Категория: Инструкции
G01N33/555 - красное кровяное тельце
Владельцы патента RU 2509306:
Государственное научное учреждение Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии. Раскрыт способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с целью индикации овисного антигена в биоматериале. Способ осуществляют посредством приготовления стабилинизированных эритроцитов, с последующей сенсибилизацией позитивной овисной сывороткой. При этом для изготовления эритроцитарного антительного диагностикума позитивную овисную сыворотку для сенсибилизации стабилизированных эритроцитов разводят 1:200-1:400, инактивируют при 60°C в течение 30 минут, сенсибилизируют формалинизированные эритроциты из расчета: один объем 10%-ной взвеси эритроцитов, один объем позитивной овисной сыворотки в рабочем разведении (1:200-1:400), инактивированной при 60°C в течение 30 минут. Затем добавляют один объем свежеприготовленного водного 0,1-0,11%-ного раствора водорастворимого ализаринового синего индикатора. Смесь встряхивают и выдерживают в течение 60 минут при 45°C, периодически перемешивая. Способ позволяет получить обладающий высокой активностью и специфичностью эритроцитарный овисный антительный диагностикум. 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного овисного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации для индикации овисного антигена в биоматериале.
В доступной нам литературе мы не нашли данных по получению овисного эритроцитарного антительного диагностикума для РНГА. Поэтому в качестве аналога мы использовали для индикации овисного антигена в биоматериале реакцию нейтрализации антител (РНАт) и бактериологический метод.
Растворителем исследуемого материала и всех ингредиентов для РНАт является нормальная, инактивированная кроличья сыворотка, разведенная 1:100 в 0,85%-ном растворе NaCl; рН-7,1. В реакции используют 2,5%-ную рабочую взвесь сухого овисного эритроцитарного антигенного диагностикума, разведенного 0,85%-ным раствором NaCl. Реакции ставят в прозрачных полистироловых планшетах с лунками в четыре ряда: первый -опытный (8-10 лунок), остальные - контрольные (по 6 лунок). Исследуемый материал титруется в объеме 0,25 мл.
Затем в 1 и 2 лунки 1-опытного и второго-контрольного - рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала и разводят его с индексом 2. В третий (контрольный) ряд вносят бруцеллезный антиген в объеме 0,25 мл и также разводят с индексом 2. В качестве антигена используют взвесь убитых B.ovis в концентрации 5x108 микробных клеток. Во все лунки 1-го (опытного) и 3-го (контрольного) рядов добавляют по 0,25 мл позитивной овисной сыворотки в разведении, соответствующем 4 сывороточным (гемагглютинирующим) единицам (например, 1:800).
Определение величины минимальной гемагглютинирующей единицы специфической сыворотки проводят перед постановкой РНАт. За одну сывороточную (гемагглютинирующую) единицу принимают предельное разведение овисной сыворотки в РНГА (например, 1:3200), вызывающее четкую агглютинацию эритроцитов на 4 креста.
Во все лунки второго (контрольного) ряда добавляют 0,25 мл 1%-ной нормальной сыворотки кролика. В четвертом (контрольном) ряду разводят овисную позитивную сыворотку в объеме 0,5 мл с индексом 2, начиная с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем (контрольном) рядах и проверяют соответствие разведения свыоротки 4-м сывороточным единицам (например, 1:800). В четвертом ряду реакция должна быть позитивной не менее, чем в 2-4-х начальных разведениях сыворотки. Планшеты встряхивают и ставят в термостат при 37°-38°C на 2 часа. Затем во все лунки четырех рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5%-ной взвеси овисного антигенного эритроцитарного диагностикума. Планшеты встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 3-4 часа. При наличии овисного антигена в исследуемом материале эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки» или маленького колечка - реакция нейтрализации положительная. Если в исследуемом материале антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию, остаются свободными и склеивают сенсибилизированные эритроциты - реакция нейтрализации отрицательная. Эта реакция достаточно сложная, 3-компонентная (эритроцитарный антигенный овисный диагностикум+позитивная овисная сыворотка+иссленуемый материал), однако, она проще, по сравнению с патологическим материалом.
Преимущество РНАт заключается в возможности выявления антигена в патологическом материале, непригодном для бактериологического исследования.
Недостатками РНАт являются ее слабая чувствительность, затраты времени для ее исполнения для индикации B.ovis антигена в биоматериале и достаточно сложная методика постановки. Бактериологическое исследование при инфекционном эпидидимите баранов связано с большими затратами времени, необходимого для выявления возбудителя из биоматериала и дальнейшей ее индикации. Культуральные особенности B.ovis требуют специальных питательных сред и особых условий для роста. Поэтому мы решили разработать способ получения высокоактивного, специфичного, несложного по технологии изготовления, простого по технике постановки реакции и малозанимающего времени для проведения исследования овисного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА, лишенного указанных недостатков.
Повышение активности и упрощение технологии получения овисного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА достигается тем, что сенсибилизация стабилизированных эритроцитов с помощью коньюгатов водорастворимого ализаринового синего индикатора (АСИ) проводится по параметрам концентрации ингридиентов, pH, ионной силы среды, температуры и экспозиции.
Максимальная чувствительность и специфичность РНГА получается при следующих соотношениях ингридиентов: один объем 10%-ной взвеси эритроцитов, один объем позитивной овисной сыворотки в рабочем разведении (1:200 1:400) инактивированной при 60°С в течение 30 минут. Затем добавляют один объем свежеприготовленного водного 0,1-0,11%-ного раствора АСИ. Смесь встряхивают и выдерживают в течение 60 минут при 45°С, периодически перемешивая. После этого эритроциты отмывают 0,85%-ным раствором NaCl, содержащим 0,5% нормальной сыворотки крови кролика, инактивированной при 60°С в течение 30 минут, pH - 7,0-7,2. По окончании отмывания, путем центрифугирования, взвесь эритроцитов вносят в физиологический раствор с целью получения 2,5%-ной концентрации эритроцитов.
Получаемый при этом антительный овисный эритроцитарный диагностикум обладает высокой чувствительностью в РНГА и специфичность. Благодаря эффективности метода при низкой активности антител в рабочих растворах сывороток - сенситин - возможно получение антительных диагностикумов на основе малоактивной сыворотки.
Предварительно активность изготовленных антительных диагностикумов проверяли в РНГА, при исследовании овисного антигена для РДСК (реакция длительного связывания комплемента), приготовленного ООО НПФ «Биоцентр», г.Омск, в предельных разведениях. При этом РНГА приготовленного нами диагностикума выявила овисный антиген - 0,045 мг антигена в 1 мл или 0,0225 мг в 0,5 мл, так как реакция ставится в объеме 0,5 мл.
Специфичность РНГА диагностикума изучали путем исследования лимфоузлов и органов от 10 здоровых баранов (240 объектов) и 4 овцематок, привитых вакциной из штамма B.melitensis Rev-1 (60 объектов). Всего исследовали 300 проб, и во всех случаях были получены отрицательные результаты, что подтверждает высокую специфичность РНГА с приготовленным нами овисным антительным эритроцитарным диагностикумом.
Убедившись в специфичности РНГА с антительным эритроцитарным овисным диагностикумом (Прикаспийского зонального НИВИ), мы исследовали патологический материал (лимфатические узлы и паренхиматозные органы) 10 баранов (53 объекта) из неблагополучного по инфекционному эпидидимиту хозяйства и 20 морских свинок (123 объекта), экспериментально зараженных культурой B.ovis. Исследование проводили бактериологическим методом, РНАт и РНГА с антительным диагностикумом Прикаспийского зонального НИВИ (табл.).
Проводили испытание антительного овисного эритроцитарного диагностикума, в сравнении с реакцией нейтрализации антител и бактериологическим методом. Результаты исследования представлены в таблице.
Результаты исследования РНГА, РНАт, бактериологическим методом биологического материала от животных в различной эпизоотической ситуации
Как видно из таблицы, при исследовании 176 объектов патологического материала от 30 животных из групп с различной эпизоотической ситуацией, положительные результаты в РНГА были получены в значительно большем числе случаев, чем бактериологическим методом и РНАт, что свидетельствует о более высокой чувствительности РНГА с антительным диагностикумом.
Чувствительность и специфичность РНГА с овисным антительным эритроцитарным диагностикумом проверяли путем исследования единого бруцеллезного антигена для PA, PCK и РДСК (S-формы), антигенов, изготовленных из штаммов В.abortus 16/4, 1096 (R-формы) и овисного антигена биофабричного приготовления.
В результате испытания отмечена высокая активность при исследовании гомологичного (овисного) антигена, тогда как с единым бруцеллезным антигеном для PA, PCK, РДСК (S-формы) получены отрицательные результаты.
Кроме того, было установлено, что овисный антительный диагностикум в РНГА также выявляет бруцеллезный антиген в R-форме, так как B.ovis находится в стойкой R-форме.
Абуталипов А. Сравнительная диагностическая эффективность РИД, РНАт и бактериологического метода при бруцеллезе. Вестник с/х науки Казахстана, 1982, №5, с.75-77.
Ромахов В.А. Разработка и совершенствование средств, методов диагностики и системы мероприятий по борьбе с инфекционным эпидидимитом баранов и бруцеллезом животных. Дисс. д.в.н. в форме научного доклада, 1992.
Садыков С.Ж. Диагностическая эффективность РНГА и РНАт при бруцеллезе, «Ветеринария», 1974, №6, с.107-108.
Хаиров С.Г. Юсупов О.Ю. Испытание эритроцитарного антигена в РНАт и РТНГА. Материалы юбелейн. научно-практ. конф. ГНУ Прикасп. ЗНИВИ, Махачкала - 2003. С.42-44.
Чернышева М.И. с соавт. Сухой эритроцитарный диагностикум для реакции пассивной гемагглютинации и РНАт при бруцеллезе, ЖМЭИ, 1970, №12, с.171.
Способ получения эритроцитарного антительного овисного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для индикации B.ovis антигена в биоматериале, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана с последующей сенсибилизацией позитивной овисной сывороткой, отличающийся тем, что впервые позитивную овисную сыворотку для нагрузки формалинизированных эритроцитов разводят 1:200-1:400, инактивируют при 60°C в течение 30 мин, добавляют один объем свежеприготовленного 0,1-0,11%-ного раствора водорастворимого ализаринового синего индикатора (АСИ), смесь встряхивают и выдерживают в течение 60 мин при 45°C, периодически перемешивая, после этого эритроциты отмывают 0,85%-ным раствором NaCl, содержащим 0,5% нормальной сыворотки крови кролика, инактивированной при 60°C в течение 30 мин, pH - 7,0-7,2, по окончании отмывания, путем центрифугирования, взвесь эритроцитов вносят в физиологический раствор с целью получения 2,5%-ной концентрации эритроцитов.
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам оценки адаптационных возможностей организма в критические периоды онтогенеза у подростков, и может быть использовано при оценке в критические периоды онтогенеза состояния организма: здоровья, адаптации и состояния напряженной адаптации.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано для обнаружения антител к протективному антигену в сыворотках людей и животных, больных сибирской язвой, в сыворотках зараженных, а также иммунизированных протективным антигеном животных.
Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и иммунологии.
Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к способу фракционирования эритроцитов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано как экспресс-метод оценки уровня специфической активности (количества живых бактерий в дозе препарата) пробиотиков различных лекарственных форм (лиофилизированная биомасса, таблетки и суппозитории) и производственных штаммов по уровню их адгезивной активности.
Изобретение относится к ветеринарно-медицинской службе.
Обозначения:«+»— признак положительный; «-» — признак отрицательный;
«d» — признак варьирует у различных штаммов.
Возбудитель псевдотуберкулеза по ряду свойств сходен с возбудителем чумы (Y. pestis) и в ряде случаев, главным образом при исследовании материала от грызунов (особенно в природных очагах чумы), когда посевы из органов производят непосредственно на плотные питательные среды, может возникнуть необходимость дифференциации этих возбудителей. Основные отличительные признаки Y. pseudotuberculosis и Y. pestis представлены в таблице 33.
Тест или свойство
Подвижность при 37° С
Подвижность при 25° С
Чувствительность к фагу при 37° С
Чувствительность к фагу при 25° С
Реакция с антисывороткой к фракции 1 Y.pestis
Патогснность для мышей
Патогснность для белых крыс
Патогснность для морских свинок
Патогснность для кроликов
Наиболее ценными для дифференциации этих возбудителей являются тесты, характеризующие их отношение к мочевине, подвижность, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы. Кроме того, следует учитывать неприхотливость к питательным средам Y.pseudotuberculosis и отсутствие полиморфизма у колоний Y.pestis, который обычно растет на специальных средах, и при 28° С на вторые сутки образует колонии только
R-формы. При подозрении на выделение Y.pestis дальнейшую идентификацию проводят в специализированных учреждениях.
Культуры, отнесенные к видам Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis, подвергают серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле. Завершающим этапом является определение патогенных свойств выделенных штаммов иерсиний.
Серологическая индикация и идентификация иерсиний. Y.enterocolitica имеют соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены.
У вирулентных штаммов обнаруживаются V- и W-антигены, расположенные в наружной мембране клетки. У отдельных штаммов имеется антиген К1, связанный с фимбриями и разрушающийся только автоклавированием при 120° С в течение час.
О-антигены возбудителя кишечного иерсиниоза являются полисахаридами, устойчивыми к нагреванию и действию этанола. Согласно классификации Winbland—Wauters по О-антигену различают более 60 сероваров Y.enterocolitica, которые обозначают арабскими цифрами 1,2 и т.д. Часть сероваров имеет разделение на субсеровары, обозначаемые буквами a, b и т.д. Также буквами обозначают и жгутиковый термолабильный антиген, разрушающийся при кипячении.
Наиболее распространенными среди животных и людей являются серовары: 0l,2a,3; 02a, 2b,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; 010; 013,7; 014; 015; 018; 019, 8; 020; 021 и 022.
Y.enterocolitica серовара О3 распространены на всех континентах. Частота их обнаружения на территории России составляет от 15 до 60% и более. Далее следуют серовары 04,32 и 05,27 (10-50%), 07,8 (5-10%) и 09 (1-30%). Другие из названных сероваров встречаются значительно реже. Часть культур типировать не удается.
Y.pseudotuberculosis имеют жгутиковый антиген (Н), 2 соматических (О) антигена S и R, антигены вирулентности — V и W, расположенные в наружной мембране и выраженные при температуре культивирования иерсиний 37° С. Н-антиген образуется при температуре 18-20° С, термолабилен и не имеет диагностического значения. R-антиген является общим для всех псевдотуберкулезных бактерий, а также и для Y.pestis. Обнаружена общность этого антигена с сальмонеллами групп В и D. По
S-антигену различают 8 сероваров Y.pseudotuberculosis, обозначаемых римскими цифрами (I-VIII). Большая часть штаммов, выделенных на территории России, как и в других странах, от животных, человека, из объектов внешней среды, относится к серовару I (60-90%). На втором месте по частоте обнаружения находится серовар III (10-30%). Серовары II, IV, V обнаруживают в 2-8% случаев. О циркуляции в нашей стране Y.pseudotuberculosis сероваров VI, VII и VIIIсведений нет.
Антигенные связи Y.pseudotuberculosis и большинства сероваров
Y. enterocolitica слабые и выявляются лишь иммунно-диффузионными методами. Более значительные антигенные взаимодействия, проявляющиеся в традиционной РА, имеют место у возбудителя псевдотуберкулеза серовара I с культурами Y.enterocolitica сероваров 08; 018 и 021.
Оба возбудителя имеют общий антиген с энтеробактериями других видов, за счет чего могут быть получены положительные реакции с сыворотками к некоторым представителям этого семейства. У Y.pseudotuberculosis установлены антигенные связи с сальмонеллами шигеллами и эшерихиями, у Y.enterocolitica — с сальмонеллами, протеями, серрациями, гафниями, клебсиеллами. Особо следует отметить наличие антигенного родства у серовара 09 с представителями рода Brucella .
В связи с этим в благополучных по бруцеллезу хозяйствах нередко выявляются неспецифические реакции с бруцеллезным диагностикумом, обусловленные инфицированием крупного рогатого скота Y.enterocolitica. Возбудитель кишечного иерсиниоза имеет антигенное родство с холерным вибрионом и возбудителем туляремии. С Y.pestis близкие антигенные связи и постоянные перекрестные положительные результаты реакций имеет возбудитель псевдотуберкулеза. Y.enterocolitica не имеет антигенных связей с Y.pestis.
Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к видам Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками к наиболее распространенным сероварам иерсиний. Наборы, выпускаемые для этих целей (Санкт-Петербургский институт им. Пастера), включают сыворотку, поливалентную к I-V сероварам, и сыворотки, моновалентные к I и III сероварам Y.pseudotuberculosis, а также сыворотки к сероварам: 03; 04,32; 04,33; 05,27; 05; 06,30; 07,8; 08; 09 и 013,7 Y.enterocolitica.
Реакция агглютинации ставится по общепринятой методике. С этой целью из флакона пастеровской пипеткой набирают сыворотку, не захватывая при этом осадка со дна флакона. Каплю сыворотки наносят на предметное стекло и тщательно растирают в ней петлю 20-24-часовой агаровой культуры испытуемого штамма. После получения гомогенной суспензии стекло покачивают осторожными круговыми движениями. Положительная реакция (агглютинация) наступает сразу или не позднее 2-
3 мин в виде склеивания бактериальной массы с образованием плотных, с трудом разбивающихся зернышек. Жидкость при этом полностью или частично просветляется.
При отрицательной реакции смесь сыворотки и бактериальной массы остается в виде равномерной гомогенной взвеси.
В последние годы разработан и успешно апробирован ряд методов диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, направленных на обнаружение возбудителей или их антигенов в патологическом материале от павших животных, а также в копрофильтратах и моче больных животных с подозрением на псевдотуберкулез и иерсиниоз.
Иммуноферментный анализ (ИФА). В последнее десятилетие установлена прямая зависимость между степенью выраженности вирулентных свойств Y.pseudotuberculosis и концентрацией антигенов вирулентности в наружней мембране. Показано, что для реализации адгезии возбудителя к эпителию слизистой оболочки кишечника с последующей инвазией и размножением в эпителии и макрофагах необходима экспрессия белков наружной мембраны (БНМ) — антигенов вирулентности. Данное обстоятельство делает перспективным использование БНМ с диагностическими целями.
В настоящее время разработано и апробировано 3 варианта тест-систем для ИФА, направленного на обнаружение БНМ иерсиний:
ИФА-ЛПС — псевдотуберкулезная система с широким спектром применения как для диагностики псевдотуберкулеза, так и для решения эпидемиологических вопросов. Чувствительность метода —10 5 микробных клеток в 1 см 3 пробы, что соответствует 100 мкг/мл липополисахарида возбудителя. Эффективность метода 70,2-81,1%;
ИФА-БНМ-1 — тест-система для ранней диагностики псевдотуберкулеза. Обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять возбудителя в органах и тканях животных, копрофильтратах и моче. Она наиболее эффективна при исследовании материала в начальный период болезни, когда антигены обнаруживают в 69-84% проб копрофиль-тратов и в 21-38% проб мочи. Чувствительность метода 10 s -5х10 5 микробных клеток в 1 см 3 ;
ИФА-БНМ-П — тест-система для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в материалах от больных (копрофильтраты, моча), павших и вынужденно убитых животных.
Для определения видовой принадлежности выявленных иерсиний (антигенов возбудителя) пробы, давшие положительную реакцию в тест-системе ИФА-БНМ-П, проверяют в тест-системе ИФА-ЛПС для выявления возбудителя (антигенов) псевдотуберкулеза.
Чувствительность метода — 10 5 микробных клеток в 1 см 3. эффективность — до 83,6% положительных проб при исследовании копрофильтратов в первые 5 дней болезни. На пике инфекционного процесса данным методом выявляют до 70% инфицированных животных.
Для исследования материала в тест-системе ИФА-БНМ-П копрофильтраты, выпот брюшной полости вносят в фосфатно-буферную или буферно-казеиново-дрожжевую среду в количестве 1 г на 5 см 3 среды для подращивания при температуре 3-7° С. Внутренние органы и ткани растирают с этими средами в ступке (соотношение 1:5). Образцы исследуют в первые сутки получения проб и затем на 3-5-е сутки от начала подращивания. Мочу исследуют в нативном виде.
Результаты учитывают визуально или спектрофотометрически. В первом случае реакцию оценивают в крестах по интенсивности появляющегося коричневого окрашивания в лунках. Положительной считают реакцию с пробой, которая дала реакцию не менее чем на ++, и по интенсивности окраски существенно отличается от проб отрицательного контроля (К-, оцененные как «-» или «+»). Положительные результаты должны быть и в пробе с положительным контролем (К +).
При спектрофотометрическом учете результатов содержимое лунок с отрицательным контрольным образцом (К-) используют в качестве нулевого контроля. Измерение оптической плотности проводят при длине волны 450 нм и считают результат положительным, если коэффициент поглощения светового потока исследуемого образца достигает величины не менее 0,05.
Наборы компонентов для постановки всех трех вариантов ИФА разработаны Санкт-Петербургским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Каждый из компонентов рассчитан на проведение 192 анализов, включая контроли.
Реакция коагглютинации (РКА). Для постановки РКА пробы мочи и копрофильтратов (с подращиванием и без него) прогревают в водяной бане в течение 30-40 мин, центрифугируют, фильтруют и исследуют надосадочную жидкость. Сыворотку крови исследуют в нативном состоянии.
На предметное стекло, разделенное на необходимое число секторов, наносят капли исследуемого материала. В каждую из капель исследуемого образца добавляют по 1 капле коагглютинирующих диагностикумов различных видов и сероваров иерсиний, в последнюю каплю вносят взвесь несенсибилизированных стафилококков (отрицательный контроль). В качестве положительного контроля на отдельном предметном стекле смешивают по 1 капле каждого использованного диагностикума с 1 каплей липо-полисахарида соответствующих бактерий в концентрации 10-20 мкг/см 3. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская слияния проб, расположенных рядом. Результат реакции учитывают через 5-30 минут экспозиции стекол во влажной камере по образованию хлопьев агглютината стафилококков и просветлению жидкости.
РКА наиболее эффективна в начальный период острого заболевания (1-5-й дни), при других формах — в сроки максимальной выраженности клинических признаков. По данным различных авторов чувствительность данного метода исследований составляет 10 5 -10 8 микробных клеток/см 3. Эффективность при кишечном иерсиниозе —до 85%, при псевдотуберкулезе — до 60-70% в первые 5 дней от начала болезни. В отличие от РА при постановке РКА не наблюдается перекрестных реакций с другими представителями энтеробактерий, бруцеллами. Использование РКА сокращает сроки исследования на иерсиниоз с 14-17 до 3-4 суток в сравнении с традиционным бактериологическим исследованием.
Реакция латекс-агглютинации (РИА). РИА используют для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в копрофильтратах и в смывах с объектов внешней среды. В отличие от РКА, в качестве носителей иммуноглобулинов используют частицы латекса, которые не обладают антигенностью, а потому предпочтительнее стафилококка. Латексный псевдотуберкулезный диагностикум выпускается Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сывороток. Сконструированы латексные диагностикумы и для индикации Y.enterocolitica сероваров О3; О5, 30; О7,8.
Чувствительность метода — 10 6 микробных клеток в 1 см 3 исследуемой пробы. Диагноз на псевдотуберкулез данным методом может быть подтвержден у 73% больных животных.
Большинство штаммов Y.enterocolitica, выделяемых на территории Российской Федерации от животных, человека и из объектов внешней среды, относятся к сероварам О3; О9; О5, 27; О8; О6, 30. В Европе преобладают бактерии сероваров О3 и О9, в США — О8, на Дальнем Востоке — О6.
В многочисленных работах, посвященных изучению иерсиниозов у животных, сообщается, что практически на всех территориях от свиней изолируют Y.enterocolitica сероваров О3; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07; 08; 09; 011;012;017 и 019,а иерсиний, выделенные от крупного рогатого скота, относятся к сероварам О3; 04; 05,27; 07,8; 012; 013 и 018.
Определение патогенностиY.pseudotuberculosis являются безусловно патогенными микроорганизмами. У них, в отличие от Y.enterocolitica, отсутствует зависимость вирулентности от наличия плазмиды, контролирующей синтез V- и W-антигенов и кальцийзависимость роста, поскольку бесплазмидные варианты сохраняют инвазивные и цитотоксические свойства. Это указывает на определяющую роль хромосомного контроля основных патогенных свойств Y.pseudotuberculosis. Поэтому выделение чистой культуры, отнесение ее к виду Y.pseudotuberculosis и определенному его серовару являются достаточными основаниями для постановки диагноза на псевдотуберкулез. Однако и в этом случае иногда прибегают к постановке биопробы. С этой целью ставят кератоконъюнктивальную пробу (тест Шереня) на морских свинках. При этом в один из конъюнктивальных мешков животного инокулируют каплю суспензии испытуемого штамма концентрацией 10 10 микробных тел. При положительном результате в течение 48-72 час развивается гиперемия конъюнктивы, отек век и сужение глазной щели, наблюдают серозно-гнойное истечение.
Возможно использование для постановки биопробы и белых мышей, которых заражают орально, внутривенно или внутрибрюшинно. В зависимости от метода инокуляции псевдотуберкулезного возбудителя, животные погибают на 3-9-е сутки. На вскрытии обнаруживают увеличение печени и селезенки, которые имеют многочисленные некротические очажки, напоминающие туберкулезные бугорки, но в отличие от них, не подвергающиеся обызвествлению. Аналогичные абсцессы или узелки обнаруживают и в легких.
К безусловно патогенным Y.enterocolitica относятся бактерии сероваров 03; 04, 32; 05; 05, 27; 06, 30; 07,8; 08; 09 биоваров IIи IV, реже I и III.Наряду с ними выделяется и значительная часть апатогенных иерсиний. При этом принадлежность того или иного штамма к определенному серологическому и биологическому варианту далеко не всегда подтверждает либо опровергает его этиологическую значимость. Имеется достаточно сообщений о выделении патогенных штаммов иерсиний серо-биоваров, ранее считавшихся непатогенными, и наоборот. Из-за столь неоднозначной роли различных серобиоваров Y.enterocolitica в патологии животных для правильного решения вопроса о патогенности того или иного штамма, а следовательно, и для правильной постановки диагноза необходимы дополнительные исследования его факторов вирулентности.
Для большинства патогенных штаммов Y. enterocolitica характерны выраженные адгезивные свойства, обусловливающие колонизацию возбудителя на энтероцитах, а также энтеротоксигенность. Продуцируемый возбудителем в больших количествах термостабильный энтеротоксин весьма сходен с таковым энтеротоксигенных неинвазивных эшерихий.
Механизм действия термостабильного энтеротоксина Y.enterocolitica связан с активацией аденилатциклазы в эпителиальных клетках кишечника, что ведет к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и нарушению водноэлектролитного баланса и энтеросорбции. В реализации действия энтеротоксина принимают участие и простоглаидины. Наблюдаемая при этом колонизация энтероцитов при минимальной инвазии или ее отсутствии подтверждает важную роль энтеротоксина в патогенезе кишечного иерсиниоза. Энтеротоксигенные Y.enterocolitica вызывают у животных и человека диареи различной интенсивности.
Штаммы Y.enterocolitica, обладающие инвазивностью, способностью размножаться в органах и тканях организма хозяина, вызывают генерали зованную инфекцию. Корреляции между эптеротоксигенностью и инвазивностью у данного возбудителя не установлено.
В отличие от Y.enterocolitica, у Y.pseudotuberculosis установлены максимальная инвазивность, цитотоксичиость и способность к генерализации инфекции. Действие энтеротоксина Y.pseudotuberculosis на слизистую оболочку кишечника выражено значительно меньше, чем у Y. enterocolitica.
К настоящему времени установлено, что к возбудителю кишечного иерсиниоза чувствительны некоторые лабораторные животные: гибель морских свинок наблюдается при внутрибрюшном их заражении патогенными иерсиниями в дозе 3х10 9 микробных клеток в течение 24-48 часов. К подкожному введению возбудителя животные оказались устойчивы; у морских свинок конъюнктивит, а в ряде случаев абортивный кератит при введении патогенных иерсиний серовара 09 в конъюнктивальную полость. При этом штаммы серовара О3 патологической реакции не вызвали.
Лучшими способами заражения являются внутрибрюшное и подкожное введение бактерий. При этих способах аппликации иерсиний в разных опытах и для различных сероваров (О3; 08; 09; 06,30) ЛД50 возбудителя составляли от 1,5х10 7 до 2,5х10 8 микробных клеток.
При пероральном заражении мышей инфекционный процесс удавалось воспроизвести только при искусственном подавлении иммунитета (бестимусные животные, обработка иммунодепрессантами) либо на мышах-гнотобиотах.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что патогенность Y.enterocolitica для лабораторных животных изучена еще недостаточно. Дополнительную сложность в изучении данного вопроса вызывает циркуляция в природе патогенных иерсиний с различной степенью вирулентности для животных, включая и лабораторных. Вследствие этого нередко при заражении патогенными иерсиниями лабораторных животных их гибели не наблюдается, поэтому биопроба для проверки патогенности Y. enterocolitica не рекомендуется.
Выше упоминалось о том, что патогенность у Y.enterocolitica детерминируется плазмидой и сопровождается наличием у таких штаммов ряда культуральных особенностей, которые предложено использовать в качестве маркеров вирулентности.
Определение способности к аутоагглютинации. Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жидкой питательной среде и заключается в спонтанном склеивании клеток иерсиний. Для проверки данной способности в две пробирки со средой Кларка засевают чистую культуру испытуемого штамма Y.enterocolitica, полученную на МПА. Посевной материал вносят в количестве 10 6 -10 8 микробных клеток в объеме 1 см 3. Одну из пробирок инкубируют при температуре 37° С, вторую — при 25° С в течение 24-48 часов.
Патогенные иерсинии при температуре культивирования 37° С образуют обильный хлопьевидный осадок, а при 25° С — равномерное помутнение, при этом возможен небольшой, компактный осадок.
Непатогенные бактерии в обеих пробирках дают рост в виде равномерного помутнения при отсутствии хлопьев.
При длительном лабораторном хранении штаммов с частыми пересевами и культивированием при 37° С часть изначально патогенных клеток, составляющих популяцию изучаемого штамма, может утрачивать плазми-ду, отвечающую за вирулентность. При наличии в популяции 30-70% таких бесплазмидных клеток результаты теста становятся нечеткими. В таких случаях его повторяют после предварительного клонирования с целью выделения плазмидосодержащих клонов. Данную операцию можно осуществить при определении кальцийзависимости роста изучаемого штамма, что также относится к одному из маркеров вирулентности у данного вида бактерий.
Определение кальцийзависимости роста . Данный тест основан на том, что у патогенных иерсинии при культивировании их на кальцийдефицитной агаровой среде при температуре 37° С проявляется ограничение роста. Это выражается образованием колоний значительно меньшего диаметра, чем при культивировании на обычных питательных средах или при дефиците ионов Са ++, но при температуре 25° С.
Для определения кальцийзависимости готовят специальную кальцийдефицитную среду на основе коммерческого агара АГВ. На поверхность этой среды в двух чашках Петри засевают культуру испытуемого штамма, выращенную в среде Кларка при 25° С. Посев ведут с тем расчетом, чтобы получить рост изолированных колоний (от 100 до 500 клеток на стандартную чашку Петри). Одну чашку инкубируют при 37° С, вторую — при 25° С в течение 48 часов, после чего учитывают результаты теста.
Патогенные иерсинии при 37° С вырастают в виде колоний значительно меньшего диаметра, чем на чашке, инкубировавшейся при 25° С. Иног да рост может отсутствовать вовсе. Дополнительное инкубирование такой чашки при 25° С в течение 24-48 часов ведет к образованию колоний обычного размера.
Непатогенные иерсинии при обеих температурах образуют колонии обычной величины (через 24 часа диаметром 1,0-1,5 мм, через 48 часов — до 1,5-2,0 мм).
При наличии в популяции патогенных иерсинии клеток, утративших плазмиду, детерминирующую факторы патогенности, рост при 37° С отмечают в виде различного соотношения крупных и мелких колоний.
Определение температурозависимой морфологии колоний . Морфологию колоний иерсинии изучают после их 24-48-часового инкубирования при 25° С и 37° С на агаре АГВ в чашках Петри.
Учет результатов осуществляют невооруженным глазом или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют окуляр-микрометром.
При 37° С патогенные иерсинии образуют малопрозрачные, желтоватого цвета, зернистые, выпуклые колонии, диаметр которых, как правило, не превышает 1,0 мм.
При 25° С колонии патогенных штаммов сходны по морфологии и размерам с колониями, образуемыми непатогенными иерсиниями при обеих температурах инкубирования. Они более прозрачны, голубоватого цвета, плоские, маслянистой консистенции, имеют диаметр в 1,5- 3 раза больший, чем у патогенных иерсинии, вырастающих при 37° С.
Определение пиразинамидазной активности. Тест основан на способности непатогенных Y.enterocolitica продуцировать пиразинамидазу и отсутствии такой способности у патогенных штаммов.
Для выполнения теста готовят специальную плотную питательную среду с пиразинкарбоксиамидом. В пробирку со скошенной питательной средой высевают культуру испытуемого штамма и инкубируют посевы в течение 48 часов при 25-30° С. По окончании инкубирования на поверхность среды с выросшими колониями наносят 1%-ный водный свежеприготовленный раствор железистого сульфата аммония. Учет результатов теста проводят через 15 минут.
Колонии непатогенных иерсинии, продуцирующих пиразинамидазу, приобретают розовую окраску, патогенных — не изменяют своего цвета.
Серологическая идентификация вирулентных иерсинии в реакции агглютинации на стекле (РА-СВИ) . Вирулентные иерсинии выявляют с помощью диагностической сыворотки к вирулентным иерсиниям (СВИ) в РА на стекле.
Комплект для РА с сывороткой диагностической к вирулентным иерсиниям (СВИ) содержит СВИ с рабочим разведением 1:10 и 10 %-ную нормальную кроличью сыворотку («К-» для контроля специфичности).
Для постановки реакции на обезжиренное предметное стекло наносят
1 каплю СВИ и 1 каплю «К-». В обе капли добавляют по одной петле культуры испытуемого штамма, выращенной на МПА при 25-37° С, и растирают биомассу до образования гомогенной суспензии. Затем стекло осторожно покачивают, наблюдая за результатом реакции.
Положительная РА вирулентных иерсиний с СВИ характеризуется появлением крошек агглютината в течение 3 минут. Агглютинат лучше заметен на темном фоне при косом освещении. В суспензии с нормальной сывороткой («К-») агглютинат образовываться не должен.
При отрицательной реакции в обеих каплях сохраняется равномерная, гомогенная суспензия бактерий.
Реакция агглютинации. Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены, представляющие собой суспензию инактивированных формалином культур эталонных штаммов Y.enterocolitica сероваров 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 07,8; 09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III концентрацией 10 млрд. микробных клеток в 1 см 3. Перед постановкой реакции, которую осуществляют методом равных объемов, антигены разводят до рабочей концентрации 1 млрд/см 3 (1:10).
При кишечном иерсиниозе характер гуморального иммунного ответа в значительной степени зависит от тяжести и клинического проявления болезни. Высокие титры антител обнаруживаются при тяжелом поражении суставов и септической форме инфекции. При легком течении, особенно при гастроэнтероколитах, антитела выявляют в более низких титрах, однако и в этом случае их уровень часто достигает диагностических величин. Выше упоминалось о наличии у иерсиний общих внутриродовых антигенов и антигенов, обуславливающих перекрестные реакции с рядом энтеробак-терий других родов, бруцеллами. Однако на пике инфекционного процесса уровень видо-серовароспецифических антител, как правило, значительно превышает уровень гетерологичных антител. Этим обусловлен минимальный диагностический титр в РА, равный 1:160-1:200. Лучше использовать метод парных сывороток крови, при котором достоверным считается 2-4-кратное и более нарастание титров антител. Антитела к Y.enterocolitica начинают выявляться со 2-й недели болезни.
К антигенам антитела в крови появляются уже к концу первой недели болезни, а существенное увеличение титров (1:200 и более) отмечают к началу 3-й недели. Этими сроками определяется необходимость использования, как и при кишечном иерсиниозе, метода парных сывороток при постановке РА. Через 2 месяца наблюдается снижение концентрации антител, и к 6 месяцам их титры обычно не превышают значений 1:50-1:100.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). В последнее время для серодиагностики иерсиниозов все шире применяется РНГА, как тест более чувствительный в сравнении с РА. С этой целью разработаны моновалентные антигенные эритроцитарные диагностикумы к Y.enterocolitica сероваров 03; 05; 07,8; 06,30; 09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III, двухвалентный диагностикум к сероварам 03 и 09, а также поливалентный диагностикум дополнительно содержащий псевдотуберкулезный антиген.
РНГА применяют со 2-3-й недели болезни, используя метод парных сывороток. Диагностический титр — разведение сыворотки 1:100 и более.
РНГА с использованием антительных эритроцитарных диагностикумов используется для обнаружения иерсиниозных антигенов в патологическом материале и в объектах внешней среды. Исследуемый материал при этом перед исследованием подращивают 3-5 суток, инактивируют при 56° С и берут для исследования надосадочную жидкость.
Иммуноферментный анализ (ИФА) . Для дифференциации специфического иммунного ответа, возникающего в острый период иерсиниоза и псевдотуберкулеза, от неспецифических антител используют иммуноферментное определение количественного содержания IgM и IgG.
В острый период данных заболеваний в сыворотке крови преобладают IgM, которые замещаются IgG к концу первого месяца от начала инфекционного процесса. Поэтому обнаружение специфических IgM при однократном исследовании проб крови может с большой долей вероятности подтвердить клинический диагноз.
Используется твердофазный ИФА в пластинах и ДОТ-ИФА.
В первом случае реакцию учитывают визуально по изменению окраски содержимого лунки планшета либо спектрофотометрически по оптической плотности продукта реакции, которая у положительных образцов должна превышать в 2-3 раза таковую в контрольных пробах.
ДОТ-ИФА проводят на нитроцеллюлозных мембранах. Данный вариант анализа не уступает по чувствительности твердофазному, но проще его в техническом исполнении. При этом используются микроколичества антигена, а результаты оцениваются визуально. Положительным результатом считается появление коричневых точек па фильтрах с исследуемыми образцами при отсутствии окрашивания в контроле.
Чувствительность ИФА превышает чувствительность РА и РНГА в 10 раз. Антитела при псевдотуберкулезе выявляются начиная с 3-й недели болезни. Диагностический титр 1:256 и более.
Наибольшие трудности представляет дифференциация иерсиниоза, обусловленного сероваром 09, от бруцеллеза. Это связано с выраженным антигенным родством их возбудителей. В таких случаях, помимо постановки серологических реакций Райта, Хеддельсона, Роз-Бенгал на бруцеллез, перспективно применение метода дифференциации иерсиниоза и бруцеллеза по классам иммуноглобулинов (М и G) в ИФА. При этом в качестве специфического антигена используют убитую ацетоном культуру Br.abortus. Стандартный антиген представляет собой взвесь убитых ацетоном бруцелл концентрацией 10 млрд./мл. Перед постановкой реакции антиген разводят 1:10 (рабочая концентрация 1 млрд./мл) 0,9%-ным раствором натрия хлорида.
Методика приготовления компонентов реакции, техника постановки и учета ИФА изложены в инструкции по применению пероксидазных конъюгатов к иммуноглобулинам М и G, выпускаемым ТОО «Полигност» (Санкт-Петербург).