Медицина Об УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИЙ ПО ИММУНОСЕРОЛОГИИ

Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D, представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с контрольным реактивом, не содержащим резус - антител.

Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные - универсальные с титром неполных резус - антител не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус.

Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус - антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.

При изготовлении реактива антирезус необходимы:

- полиглюкин, высушенный лиофильным способом;

- альбумин - 2,5% раствор;

- изотонический раствор NaCl;

- образцы резус - положительной и резус - отрицательной крови.

1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку ведут во флаконах емкостью 250-500 мл.

2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20% раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором NaCl.

Изготовление реактива антирезус.

Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем 1:64 - 1:128 <*> переносят во флакон с предварительно высушенным полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина, высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация полиглюкина составит 6%.

<*> Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титром можно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV), стандартным разводителем или 2,5% раствором альбумина в изотоническом растворе NaCl.

Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания до полного растворения порошка полиглюкина.

Изготовление контрольного реактива.

Для изготовления контрольного реактива в другой такой же флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют стандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же до исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до полного растворения порошка полиглюкина.

Исследование качества изготовленных реактивов.

Исследование реактивов производят непосредственно после их изготовления с резус - положительными и резус - отрицательными эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности реакции:

на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл) реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного реактива;

в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл) резус - положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной капле резус - отрицательных эритроцитов. Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на три минуты периодически покачивая пластинку;

через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капель изотонического раствора NaCl, перемешивают и через две минуты учитывают результат.

Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус - положительных и с 30 образцами резус - отрицательных эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ccddee и ccddEe.

Учет и оценка результатов.

Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус - положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус - отрицательными эритроцитами (ccddee) и эритроцитами фенотипа Ccddee и rccddEe.

Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупнозернистой агглютинации резус - положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ccddee) и эритроцитами фенотипа CcddEe и ccddEe.

Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.

Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 г. на 100 мл реагента.

Розлив и паспортизация.

Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.

На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества,номера серии и срока годности.

Контрольный реактив разливают в таких же объемах и в том же количестве ампул (флаконов), и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.

Хранение, срок годности и контроль.

Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином и контрольный реактив хранят при 4-8 град. С. Срок годности 4 месяца.

Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют на активность и специфичность через месяц.

Выдача реактива антирезус.

Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольным реактивом.

К каждому комплекту (или набору комплектов) придается инструкция по использованию.

"Инструкцию по определению резус - принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 06 декабря 1990 года N 05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления организации

медицинской помощи населению

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ D АНТИГЕНА СИСТЕМЫ РЕЗУС

(АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИ-D)

<*> Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.

Цоликлон анти-D предназначен для выявления D антигена системы резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.

Порядок установления резус - принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус - принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году и Методическими рекомендациями по определению резус - принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.

2. Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-D

Действующим началом Цоликлон анти-D являются моноклональные анти-D антитела, продуцируемые лимфобластоианой линией клеток человека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против D антигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являются моноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов, полностью идентичны по структуре и биологической активности.

Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-D антитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключена контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.). Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через кровь.

Цоликлон анти-D представляет собой неразбавленную или разведенную солевым раствором культуральную жидкость, кондиционированную клетками - продуцентами антител. Анти-D моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G (IgGl). Цоликлон анти-D не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.

Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G (неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов, содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакции конглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробе Кумбса), в реакции агглютинации эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированных системах типа "Группоматик".

3. Техника определения D-антигена системы резус

Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов; в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции агглютинации.

3.1. Непрямой антиглобулиновый тест

(непрямая проба Кумбса)

Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена. Взвесь (2-3%) в физиологическом растворе трижды отмытых исследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 мл взвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату ((0,05 мл/ячейку), добавляют равный объем Цоликлона и инкубируют в течение 45-60 минут при 37 град. С. Затем после однократного отмывания физиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05-0,1 мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленно или через 15-30 минут инкубации при комнатной температуре центрифугируют при 200 g в течение 15-20 секунд. Осадок мягко взвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемых макро- или микроскопически, делают заключение о присутствии D антигена в исследуемых эритроцитах.

3.2. Реакция конглютинации с желатином

В агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05-0,1 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли (0,1-0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно прогретого при 45-50 град. С до разжижения, и одну каплю Цоликлона анти-D. Суспензию тщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут в водяной бане или 30 минут в термостате при 48 град. С, прибавляют 5-6 мл физиологического раствора и после осторожного переворачивания пробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них D антигена.

3.3. Реакция с препаратом на основе полиглюкина

Полиглюкин практически всегда вызывает неспецифическую агглютинацию D-отрицательных эритроцитов, поэтому невозможно объективное заключение об отсутствии D антигена или о наличии его слабого варианта в исследуемых эритроцитах. В связи с этим использование полиглюкина для моноклональных антител не рекомендуется.

3.4. Реакция агглютинации с эритроцитами, обработанными

Цоликлон анти-D, содержащий моноклональные антитела класса IgG, способен вызывать прямую агглютинацию D-положительных эритроцитов, обработанных такими протеолитическими ферментами как бромелин, папаин и др. и поэтому может применяться в автоматических системах типирования крови.

3.5. Контроль специфичности реакции агглютинации

Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики исследования) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты. Желательно также включение образцов со слабовыраженным D антигеном.

4. Форма выпуска

Цоликлон анти-D выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8 град. С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.

Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.

При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.

Рекламацию следует направить на предприятие - изготовитель.

"Инструкцию по применению Цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (Антитела моноклональные анти-D)", утвержденную Главным техническим Управлением Минздрава СССР 21 августа 1990 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления организации

медицинской помощи населению

<*> Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.

Цоликлон анти-D Супер предназначен для выявления антигена D системы резус в эритроцитах человека.

Порядок установления резус - принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус - принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году, и Методическими рекомендациями по определению резус - принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.

В связи с тем, что IgM антитела не вызывают агглютинации некоторых образцов эритроцитов со слабовыраженным D антигеном (Du), образцы донорской крови, которые при исследовании Цоликлоном анти-D Супер были определены как D-отрицательные, необходимо дополнительно тестировать с помощью анти-D реагентов, содержащих IgG-антитела (поликлональной сывороткой или моноклональным анти-D IgG реагентом).

2. Характеристика и основные свойства

Цоликлона анти-D Супер

Действующим началом Цоликлон анти-D Супер являются моноклональные анти-D антитела, которые продуцируются гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой лимфобластоидной линии и миеломной клеточной линией мыши.

Цоликлон анти-D Супер изготовлен на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками - продуцентами антител Анти-D. Реагент не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.

Моноклональные антитела, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов - IgM, полностью идентичны по структуре и биологической активности. Анти-D антитела класса М являются полными антителами, т.е. вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, содержащих D антиген. Цоликлон анти-D Супер может быть использован для выявления D антигена в любых вариантах прямой реакции агглютинации: на плоскости, в пробирках, в микроплате.

3. Определение D-антигена системы резус

Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной консервантом; в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца.

3.1. Реакция агглютинации на плоскости

На пластину со смачиваемой поверхностью нанесите большую каплю (около 0,1 мл) реагента. Рядом поместите маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешайте кровь с реагентом. Наиболее крупная агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 секунд, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 секунд. Использование подогретой до 37-40 град. С пластинки сокращает время наступления агглютинации. Результаты реакции учитывайте через три минуты. Пластинку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 секунд, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.

3.2. Реакция агглютинации в пробирках

В круглодонную пробирку внесите одну каплю (около 0,1 мл) реагента и добавьте одну каплю 5% суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе. Содержимое пробирки тщательно перемешайте встряхиванием и инкубируйте 30 минут при комнатной температуре. После инкубации пробирку центрифугируйте при 1500-2000 оборотах в минуту в течение одной минуты. Мягко покачивая пробирку, отслоите осадок ото дна. При отрицательном результате осадок эритроцитов разбивается, образуя непрозрачную гомогенную суспензию. При положительном результате в пробирке видны агглютинаты на фоне прозрачной жидкости.

3.3. Реакция агглютинации в микроплате

В лунку 96-ячеечной круглодонной микроплаты внесите 0,05 мл реагента и 0,05 мл 2% суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе (эритроциты предварительно дважды отмойте). Через 45-60 минут инкубации при комнатной температуре визуально оцените результат реакции по рисунку осадка эритроцитов на дне лунки: при отрицательном результате осадок эритроцитов собирается в точку, при положительном - имеет больший диаметр, располагается неравномерным слоем, имеет неровные или завернутые края.

4. Контроль специфичности

Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.

5. Форма выпуска

Цоликлон анти-D Супер выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 2, 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

Срок хранения - один год в холодильнике при 2-8 град. С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.

Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.

При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.

Рекламацию следует направить на предприятие - изготовитель.

"Инструкцию по применению анти-Rho (D) IgM моноклонального реагента для определения резус - принадлежности крови человека (Цоликлона анти-D Супер)", утвержденную Управлением научных исследований МЗ и МП РФ 14 июля 1994 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления организации

медицинской помощи населению

Приложение N 11

Приказ Минздрава России

от 09.01.1998 г. N 2

ПО ИССЛЕДОВАНИЮ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ РЕЗУС - АНТИТЕЛ

Резус - антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки человека, а появляются в крови резус - отрицательных людей лишь при особых условиях.

Условиями, способствующими образованию резус - антител, являются введение резус - отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус - отрицательной женщины резус - положительным плодом.

Определение резус - антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью.

Определение резус - антител требуется также при подготовке материла в целях использования для приготовления сывороток антирезус.

Резус - антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.

Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус - антигены.

Полные антитела, соединяясь с резус - антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется.

Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус - антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса, реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При всех перечисленных условиях реакция между резус - антителами и эритроцитами, содержащими резус - антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.

Разные методы определения резус - антител требуют различных оптимальных для них температурных условий.

II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

1. Учет специфичности антител. Специфичность стандартных

Наиболее часто при иммунизации резус - отрицательных людей повторными трансфузиями крови или беременностями образуются антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и другие резус - антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке крови человека эту сыворотку испытывают с резус - положительными эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, C, E, c, e.

Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись, то число резус - положительных образцов должно быть не менее 20 для того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.

В качестве контроля на специфичность реакции, а также для выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные резус - отрицательные - ccddee эритроциты и, если возможно, собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.

Такое исследование является предварительным. Для уточнения специфичности требуются дополнительные специальные исследования (см. п. IX).

2. Учет формы антител

Чаще всего при иммунизации резус - антигеном образуются неполные антитела; иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только полные резус - антитела.

Поэтому определение резус - антител следует производить не менее чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим - любой метод, выявляющий неполные антитела.

III. О ВЫБОРЕ МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ РЕЗУС - АНТИТЕЛ

Ниже в п. III, IV, V, VI описаны различные методы исследования сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см. III), реакция с применением желатина (см. IV) и реакция с применением полиглюкина (см. V) выявляют неполные резус - антитела, и для этой цели может быть использован любой из них.

Метод исследования сыворотки в солевой среде (см. VI) выявляет полные резус - антитела и должен обязательно использоваться одновременно с любым из упомянутых выше.

IV. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ НЕПОЛНЫХ

РЕЗУС - АНТИТЕЛ НЕПРЯМОЙ ПРОБОЙ КУМБСА

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус - принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки доливают доверху изотоническим раствором NaCl, затем содержимое пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для исследования сыворотки.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4-10 см с внутренним диаметром 0,5-0,8 см (первые размеры удобнее). Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) испытуемой сыворотки.

в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой сывороткой согласно нумерации пробирок.

г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при температуре +37 град. С. За это время резус - антитела, если они имеются в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.

д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют, после чего надосадочную жидкость отсасывают. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3-4 раза.

е. В каждую пробирку к отмытым таким образом эритроцитам добавляют 4-7 капель изотонического раствора NaCl для получения 5% взвеси (так как при отмывании эритроциты частично захватываются, интенсивность взвеси контролируют глазом).

ж. Одну каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью и к каждой капле прибавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки, приготовленной для пробы Кумбса.

з. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (стеклянной палочкой или углом предметного стекла), после чего пластинку слегка покачивают. При этом наблюдают результат (наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов).

Агглютинация обычно начинается в течение первых 10-30 сек, но при слабом титре резус - антител может наступить до 20 мин.

3. Трактовка результата

Наличие агглютинации в каплях с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на присутствие в сыворотке неполных резус - антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус - антитела - анти-D, С, Е, с и е - не выявлены.

Определение специфичности выявленных антител см. п. IX.

4. Титрование сыворотки, содержащей

неполные резус - антитела

а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.

б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) изотонического раствора NaCl.

в. В первую пробирку (с обозначением 1:2) вводят три капли (0,15 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания ее содержимого переносят три капли в следующую и т.д. до последней пробирки, из которой три капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения испытуемой сыворотки от 1:2 до 1:1024.

г. Во все пробирки добавляют пастеровской пипеткой по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5 резус - положительных лиц и приготовленных так же, как готовят стандартные эритроциты.

д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив помещают на 45 мин в термостат при температуре +37 град. С.

е. После инкубации эритроциты отмывают и из них готовят 5% взвесь. Затем из каждой пробирки переносят одну каплю (0,05 мл) взвеси на белую пластинку и к каждой капле взвеси прибавляют одну каплю (0,05 мл) сыворотки для пробы Кумбса, которую смешивают с эритроцитами. Далее в течение пяти минут наблюдают результат при покачивании пластинки.

ж. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация (время наблюдения 5 мин), принимается за титр выявленных неполных резус - антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус - антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.

V. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ

НЕПОЛНЫХ РЕЗУС - АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления эритроцитов берут не более, чем за 2-3 дня до исследования в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус - принадлежность лица, от которого взята кровь. При этом обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые и применяют для исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской пипеткой; если при этом захватывается небольшое количество собственной сыворотки, это не влияет на ход реакции.

Если эритроцитов, оставшихся свободными после свертывания крови, недостаточно, то допускается интенсивное встряхивание свертка для отделения дополнительного количества эритроцитов.

Можно брать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты необходимо отмыть изотоническим раствором NaCl.

Для установления титра антител эритроциты готовят ex tempore. В пробирку к одной части эритроцитов добавляют 9 частей 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. При этом получается 10% взвесь эритроцитов в желатине.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

б. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.

в. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. (Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать при температуре 4-8 град. С желатин не пригоден).

г. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46-48 град. С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.

д. В пробирки по извлечении из водяной бани наливают 5-8 мл изотонического раствора NaCl. Содержимое пробирок перемешивают путем одно - двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

3. Трактовка результата

Результат реакции просматривают на свет.

Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.

Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.

Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке неполных резус - антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус - антитела анти-D, С, Е, а также с и е - не выявлены.

Определение специфичности выявленных антител см. п. IX.

4. Титрование сыворотки, содержащей

неполные резус - антитела

а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.

б. Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCl.

в. В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей - в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток от 1:2 до 1:1024.

г. Во все пробирки добавляют по две капли стандартных резус - положительных эритроцитов или смесь эритроцитов, полученных от 4-5 резус - положительных лиц и приготовленных, как сказано ниже, в виде 10% взвеси в желатине.

д. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при температуре +46-48 град. С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на 30 мин.

е. По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по 5-8 мл изотонического раствора NaCl и наблюдают результат. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимается за титр выявленных неполных резус - антител.

Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус - антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.

VI. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ

НЕПОЛНЫХ АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИГЛЮКИНА

(В ПРОБИРКАХ БЕЗ ПОДОГРЕВА)

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления эритроцитов берут не более чем за 2-3 дня до исследования в обычные пробирки. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус - принадлежность лица, от которого взята кровь. Может быть использована любая кровь: непосредственно взятая из пальца, эритроциты из осадка в пробирке после образования свертка и консервированная, отмытая изотоническим раствором NaCl.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают пробирки вместимостью 8-10 мл, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

б. Во все пробирки вводят по две капли исследуемой сыворотки.

в. Согласно нумерации в пробирки вводят по одной капле стандартных эритроцитов.

г. Во все пробирки вводят по одной капле 33% раствора полиглюкина.

д. Пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого, затем наклоняют почти до горизонтального положения и медленно поворачивают по горизонтальной оси так, чтобы содержимое растекалось по их стенкам. Контакт эритроцитов с исследуемой сывороткой при поворачивании пробирок продолжают три минуты.

е. Через 3-5 минут в пробирки наливают 3-4 мл изотонического раствора NaCl, осторожно перемешивают содержимое путем 2-3 - кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

3. Трактовка результатов

Результаты просматривают на свет невооруженным глазом.

Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в исследуемой сыворотке резус - антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные антитела анти-D, С, Е, а также с и е - не выявлены.

Определение специфичности антител см. п. IX.

VII. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ ПОЛНЫХ

АНТИТЕЛ В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ В СОЛЕВОЙ СРЕДЕ

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут в количестве 1-2 мл (и более, смотря по потребности) в пробирки вместимостью 8-10 мл, содержащие изотонический раствор лимоннокислого натрия (из расчета 0,25 мл на 1 мл крови). Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию и инициалы лица, от которого взята кровь.

После взятия крови в пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCl, затем содержимое их перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды.

Можно брать кровь и без стабилизатора. В этом случае после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.

Из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках, взятых по числу образцов стандартных эритроцитов и так же пронумерованных.

Для приготовления 2% взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл (49 капель) изотонического раствора NaCl и в каждую пробирку в соответствии с ее нумерацией переносят одну каплю эритроцитов. Содержимое пробирок перемешивают для получения равномерной 2% взвеси эритроцитов, которая применяется для исследования сыворотки.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают ряд маленьких пробирок (высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с гладким дном округлой формы) по числу образцов эритроцитов, с которыми испытывается сыворотка. Предварительно штатив покрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пробирки на бумаге пишут порядковый номер, а также фамилию, инициалы, группу крови и резус - принадлежность лица, от которого взята кровь.

Вместо пробирок можно использовать планшеты для иммунологических реакций с лунками, имеющими закругленное дно.

б. Во все пробирки (лунки планшета) вводят по одной капле (0,05 мл) испытуемой сыворотки и по одной капле изотонического раствора NaCl.

Штатив с пробирками (планшет) встряхивают для перемешивания их содержимого.

в. В пробирки (лунки), согласно их нумерации и обозначению, вводят по одной (0,05 мл) капле 2% взвеси эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.

г. Содержимое снова перемешивают и штатив (планшет) помещают для инкубации в термостат при +37 град. С на один час и затем оставляют на столе при комнатной температуре на 2-3 часа.

д. После инкубации штатив с пробирками (планшет) вынимают и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

3. Трактовка результата

Результат реакции учитывают при помощи лупы с 6-8-кратным увеличением по форме осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки) (см. "Инструкцию по определению резус - принадлежности крови методом агглютинации в солевой среде").

Наличие агглютинации с резус - положительными образцами эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывают на присутствие в сыворотке полных резус - антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что полные резус - антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.

Определение специфичности см. п. IX.

4. Титрование сыворотки, содержащей

полные резус - антитела

а. В штатив устанавливают 10 маленьких пробирок для разведения сывороток: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024. Можно использовать планшет для иммунологических реакций.

б. Во все пробирки (лунки) капают по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCl.

в. В первую пробирку (лунку) (с обозначением 1:2) вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. После перемешивания из первой пробирки (лунки) переносят две капли во вторую, из второй - в третью и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.

г. В каждую пробирку (лунку) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси стандартных эритроцитов или смеси, приготовленной от 4-5 резус - положительных лиц. Эритроциты для взвеси готовят, как сказано выше.

д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив (планшет) помещают в термостат при температуре +37 град. С на один час.